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        “洋中脊生物基因資源的研究開發”項目2010年進展

        發布日期: 2013-10-22 10:37:16

        1、深海樣品的采集、分離、培養與生物多樣性研究,公共深海生物及其基因資源保藏。

        可培養微生物:從不同地點的深海沉積物中分離產蛋白酶或多糖的菌株,建立800多株深海微生物菌種庫。分析了深海沉積物中產蛋白酶細菌及其所產蛋白酶的多樣性,發現并鑒定6個細菌新種屬;從海洋沉積物樣品中篩選獲得14株具有產電活性的細菌菌株,其中一株菌株S4代表希瓦氏菌屬的一個新種完成兩株深海細菌的基因組、功能基因組以及比較基因組研究,揭示了深海細菌對環境的適應機制;建立了深海浸礦微生物分離篩選、適應性培養技術,獲得具有浸礦能力的中等嗜熱微生物20余株;通過大規模選擇性分離和系統分類學研究獲得了一批來源于深海、有潛在的生物活性物質產生菌200余株,有效發表3個微生物新種。開展了深海PAHs降解菌、石油降解菌、熱液口重金屬抗性菌的研究,公開發表海洋細菌16個,其中4個為新屬新種。

        非培養微生物:已完成深海環境大片段基因組文庫12個:其中fosmid/ Cosmid文庫2個,BAC文庫1個,重組克隆子12萬多個;通過抗菌、抗病毒、抗腫瘤及其它功能性篩選,獲得了19個具有抗菌及細胞毒活性的克隆子,4個產黑色素克隆子,1個靛藍合成基因,8個脂肪酶克隆子和14個淀粉酶克隆子。以及氨基肽酶基因和耐鹽基因。從深海樣品中獲得了65株產酶的宏基因組文庫克隆、32個酶基因,對其中19個酶基因進行了表達。對這些酶的性質進行了分析,建立了深海微生物極端酶譜庫。

        2、 深海生物基因資源研究開發遺傳操作技術研究。

        基于對深海細菌WP3中的低溫誘導噬菌體調控機理和噬菌體-宿主相互作用關系研究的基礎上成功構建了能夠在深海希瓦氏菌-大腸桿菌中穿梭的表達載體。在攜帶巨大基因簇的載體系統的構建研究中,完成了酵母捕捉載體YCV6的構建,并克隆了來自肺炎克雷伯菌HS04044的靶序列。利用成功構建的載體系統和初步改造的深海宿主表達了來源于深海的一個降解芳香族化合物的基因簇中的4-羥基苯并酮酶,在深海菌株WP3中檢出了基因的表達。

        對一簇具海洋特性的鏈霉菌通過單一抗生素自發抗性突變、孢子間雜交組合抗性突變和PCR定點誘變組合抗性突變三種途徑實現利福霉素抗性突變和鏈霉素抗性突變菌株的快速重組。通過抗生素生物合成基因作為分子探針從深海環境宏基因組文庫中調出了PKS/NRPS及鹵化酶生物合成基因簇,通過PCR打靶技術對一個PKS/NRPS雜合基因簇進行了修飾,并將其導入和整合到鏈霉菌宿主的染色體上。對NRPS基因簇中腺苷化酶1和鹵化酶2等關鍵酶分別進行了異源表達,都獲得了可溶性蛋白并進行了體外催化活性研究。其中以色氨酸為底物的體外催化反應經LC-MS可檢測到色氨酸加氯的鹵化產物,可用于組合生物合成。

        3、活性物質研究

        在活性物質研究中,建立了以微生物的HPLC-UV, HPLC-ESI-MS/MSHPLC-NMR的組合分子識別技術,從多種海洋微生物中獲得具有明確化學結構的次生代謝產物116種(化合物純度大于98%),獲得國際上首次發現的新穎結構化合物60個(其中新骨架6個)。從海洋真菌Stemphylium sp.中制備和鑒定24個化合物,其中12個新化合物。發現3種海洋微生物產生的生物堿具有顯著的體內抗腫瘤藥效活性,對其中一種進行急性毒性研究,并對該3種活性化合物進行了理化參數和制備工藝研究。發現15種化合物具有顯著抗腫瘤活性(IC50<10mg/ml);4種具有抗糖尿病II型靶蛋白PTP1B活性,4種具有顯著抗菌活性,1種對神經因子5-羥色胺具有調控作用。對3種活性化合物進行的代謝調控和生源關系研究。其中,2株微生物經優化培養的目標產物的產率提高4-6倍,對1種目標產物進行了生物合成。通過抗腫瘤活性篩選,優選得到了一個腫瘤既生血管破壞劑MDS-11。

        在抗污損物質研究中:共獲得高效低毒抗污損活性化合物13個;確定了3類化合物的抗污損活性官能團;找到了1個極具良好應用前景無毒活性化合物丁烯酸內酯,該化合物活性顯著。建立了20kg規模深海微生物浸出黃銅礦的工藝參數,槽浸銅的最高浸出率可達90%以上;研制了深海微生物柱浸反應器(50Kg),并確定了其浸出黃銅礦的工藝參數;柱浸產銅速率達到1.08kg/(m3·d),浸出率達70%,處國際前列。

        4、 深海(微)生物產工業用酶的研究。

        建立低溫蛋白酶、木聚糖酶菌株資源庫;對木聚糖酶和褐藻酸裂解酶進行了分離純化、性質分析,小試發酵試驗,并進行了木聚糖酶在面粉改性上應用潛力分析;建立了適冷酶的高效表達系統,高效重組表達具有適冷活性的適冷酶;2個脂肪酶基因工程菌完成了500L規模的中試發酵工作,1株產瓊膠酶菌株完成了100L規模的降解龍須菜產糖的酶解條件優化。

        分離純化了4個新的蛋白酶,在國內外首次解析了M4家族金屬蛋白酶的過渡態復合物的晶體結構,揭示了M4家族金屬蛋白酶的適冷進化機制和成熟機制。分離了兩株高產木聚糖酶和褐藻酸裂解酶菌株,對木聚糖酶和褐藻酸裂解酶進行了分離純化、性質分析,小試發酵試驗,并進行了木聚糖酶在面粉改性上應用潛力分析。

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